非洲猪瘟快速免提取荧光PCR检测试剂盒（带抽提液、处理液-瓶装）说明书
一、简介
本试剂盒用一对非洲猪瘟特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用荧光PCR技术对非洲猪瘟DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。本试剂盒中非洲猪瘟的探针报告基团为FAM。
二、用途
该试剂盒适合于检测样本中的非洲猪瘟。
三、试剂盒组成（50T/Kit）
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组成成份 |
数量 |
规格 |
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样本处理液 |
1瓶 |
50mL/瓶 |
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快速荧光qPCR反应液 |
1管 |
750μL/管 |
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DNA抽提液 |
2管 |
1.5mL/管 |
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快速阳性对照 |
1管 |
50uL/管 |
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阴性对照 |
1管 |
50μL/管 |
四、储存条件及有效期
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为6个月。
五、荧光PCR仪器适用范围
ABI系列、MJ系列、Roche系列，博日系列及其他荧光定量PCR检测仪。
六、样品的采集及处理
6.1 样品的采集
组织样本：病死或活猪，取脾脏和淋巴结等组织。猪肉肉样：取3个不同部位的猪肉肉样。全血样本：使用EDTA抗凝管采集全血备用。血清样本：血液自动凝固，或8000rpm离心2min，取上清血清备用。拭子样本：需每管分装500uL样本处理液，反复涂抹采集部位及环境表面后将拭子插入样本处理液内碾磨数秒。饲料、土壤样本：需混匀至少3份不同地点样本。
6.2 样本前处理
样本可使用DNA抽提液纯化核酸后上机。复杂样本建议使用EAD001Q DNA提取试剂盒（过柱法-荧光配套）或EAR004 病毒DNA/RNA提取试剂盒（磁珠法）进行提取。
6.2.1样本处理：
组织样本、肉样：处理前需将样本处理液分装至1.5mL离心管内，每管150uL。手术剪剪碎取绿豆大小组织块，加入至样本处理液中，使用一次性研磨棒研磨至破碎。取50uL组织研磨液准备抽提。
全血样本：需每管分装450uL样本处理液，吸取50ul全血加入至样本处理液中，混匀取50uL准备抽提。
血清样本：样本本底好的血清，直接取50uL准备抽提；有溶血现象或有杂质的血清，需每管分装200uL样本处理液，吸取50ul血清加入至样本处理液中，混匀取50uL准备抽提。
拭子样本、水样本：可以直接取50uL，准备抽提。
饲料、土壤样本：取绿豆大小样本至1.5ml离心管内准备抽提。
6.2.2抽提纯化：
上述样本加入50μLDNA抽提液，100℃恒温处理5min，10,000rpm离心1min，取上清液转移至新的1.5mL EP管，-20℃保存。
注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需提取），直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
七、检测步骤
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液（qPCR MIX），融化后10,000rpm离心10s。向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照（NTC）和阳性对照（PTC）5μL，10,000rpm瞬时离心10秒。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：
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预变性 |
1循环 |
95°C for 3 min |
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PCR扩增 |
40循环 |
95°C for 5 sec 60°C for 30 sec |
在60°C 延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX 参比荧光。
八、结果分析
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
（1） 阴性对照（NTC）：不应产生任何的扩增曲线。
（2） 阳性对照（PTC）：均产生扩增曲线。
（3） 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3 结果判定
（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明核酸阳性。
（2） Ct＞40或值显示为无的样本为阴性样本，表明核酸阴性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行荧光PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明核酸阳性；否则判为样本阴性。
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